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本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般最多30mg组织或1×10⁷细胞。本试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA，几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
  • 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
• 提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
  
• Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1mL Buffer RL加10μL β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。
  
• 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
  
• Buffer RL如果产生沉淀，可于56℃加热使其溶解后室温放置。
  
• 所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

• 样品处理
  
  • 组织：将组织在液氮中磨碎。每20～30mg组织加600μL Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20mg加350μL Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的十分之一。
    
  • 单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6～10cm²培养面积加入600μL Buffer RL，小于6cm²加入350μL Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
    
  • 细胞悬液：12000rpm（~13400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×10⁶～1×10⁷细胞加入600μL Buffer RL，少于5×10⁶细胞加入350μL Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
    注意：
    ① 尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。
    ② 尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。
• 样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
  
• 12000rpm离心2～5min，取上清进行以下操作。
  
• 向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积（600μL或350μL）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。
  注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
  
• 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱RM中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。
  注意：吸附柱的最大载量为100μg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
  
• 向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 配制DNase I混合液：取52μL RNase-Free Water，向其中加入8μL 10×Reaction Buffer和20μL DNase I(1U/μL)，混匀，配制成终体积为80μL的反应液。
  
• 向吸附柱中直接加入80μL DNase I混合液，20～30℃孵育15分钟。
  
• 向吸附柱中加入200μL Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）,12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
  
• 重复步骤10。
  
• 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
  注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
  
• 将吸附柱转入新的离心管中，向吸附膜中间位置加入30～50μL RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
  注意：
  ① RNase-Free Water体积不应小于30μL，体积过小影响回收率。
  ② 如果要提高RNA的产量，可用30～50μL新的RNase-Free Water重复步骤13。
  ③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。